Elektroforesis Asam Amino
|
|
|
Elektroforesis Asam Amino
|
|
Tugas Kimia Organik
Kelas 12-4
|
|
|
|
|
|
1. Arifatin
Nurufazzah
2. Ayu
Lintang Cahyani
3. M.
Farizal Aulia hanafi
4. M.
Riandhika Vianto
5. Santi
Puspita Sanjaya
6. Syarah
Habibah Balqis
7. Syiva
Nooraini
|
|
|
|
SMK
– SMAK BOGOR
2015
|
Kata Pengantar
Assalamualaikum
Wr. Wb
Puji syukur kami panjatkan kehadirat
Tuhan Yang Maha Esa karena dengan rahmat, karunia, serta taufik dan hidayah-Nya
kami dapat menyelesaikan makalah tentang Elektroforesis Asam Amino dengan baik
meskipun masih banyak kekurangan didalamnya. Dan juga kami berterimakasih
kepada Bapak Lalu Shafwan Hadi El Wathan S.Si selaku Guru mata pelajaran Kimia
Organik SMK – SMAK Bogor yang telah memberikan tugas ini kepada kami.
Kami sangat berharap makalah ini dapat
berguna dalam rangka menambah wawasan serta pengetahuan kita mengenai Pemisahan
Asam Amino melalui Teknik Elektroforesis. Kami juga menyadari sepenuhnya bahwa
di dalam makalah ini kekurangan dan jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu,
kami berharap adanya kritik, saran dan usulan demi perbaikan makalah yang telah
kami buat, mengingat tidak adanya sesuatu yang sempurna tanpa saran yang
membangun.
Semoga makalah sederhana ini dapat
dipahami bagi siapapun yang membacanya. Sebelumnya kami mohon maaf apabila
terdapat kesalahan kata-kata yang kurang berkenan dan kami memohon kritik dan
saran yang membangun demi perbaikan di masa depan.
Bogor, November 2015
Penyusun
Daftar Isi
Bab 1. Pendahuluan
Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek
penting dalam bidang ilmu kimia karena kebanyakan materi yang terdapat dialam
dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita
harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat
diterapkan untuk memisahkan campuran .Seiring dengan kemajuan zaman yang
semakin pesat di negara-negara berkermbangakan selalu diikuti pula dengan
kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang teknologi.
metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19
setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap
partikel-partikel atau molekul-molekulyang bermuatan listrik, dalam ha1 ini
termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalamRichardson dkk, 1986).
menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasaJunani yang
mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930
oleh ilmuwan SwediaArne Tiselius, ia memisahkan protein serum sesuai dengan
change mereka dalam tabung berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan
lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi hadiah nobel pada tahun 1948. Hari
elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gelelektroforesis
dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang digunakan di
laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru
pada1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang berkembang
sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang
berbedaelektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan
capilaries.
Tujuan
a.
Mengetahui
Dasar Elektroforesis
b.
Mengetehaui
Manfaat Elektroforesis
c.
Mengetahui
prosedur kerja pemisahan asam amino dengan metode elektroforesis
Bab 2. Pembahasan
A. Kajian Teori
1. Asam Amino
Asam amino adalah sembarang senyawa
organik yang memiliki gugus fungsional karboksil
(-COOH) dan amina
(biasanya -NH2). Dalam biokimia
seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C)
yang sama (disebut atom C "alfa" atau α).
Gugus karboksil memberikan sifat asam dan
gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik:
cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam.
Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk
golongan senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya
sangat penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein.
|
Gambar 1.
Strukture Asam Amino
|
Struktur asam α-amino, dengan gugus amina di
sebelah kiri dan gugus karboksil di sebelah kanan. Struktur asam amino secara
umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2),
gugus karboksil
(COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau
rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα
("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu
atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina
juga terikat pada atom Cα ini, senyawa tersebut merupakan asam
α-amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan
berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai
samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik
jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar.
2. SDS Page
SDS-PAGE
atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium
Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis gel
yang menggunakan poliakrilamida
untuk memisahkan protein
yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil Sulfat (SDS)
merupakan deterjen ionik
yang dapat melarutkan molekul hidrofobik
yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat
interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Metode SDS-PAGE digunakan
untuk memisahkan protein
demi keperluan biokimia,
genetika forensik,
dan biologi molekuler.
Metode
ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama
sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel.[1]
Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS dan
memutus ikatan disulfida
pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol,
bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel. Selanjutnya gel poliakrilamida
dibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan
tertentu.[1]
Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik
sehingga komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel
berdasarkan berat molekulnya.
Untuk melihat pita komponen
yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus. Beberapa pewarna yang
dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie
Brilliat Blue dan Silver
Salt Staining. Commasie Brilliant Blue mengikat
protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver
Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan
proses yang lebih lama.
B. Dasar Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/
spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui
medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu
medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah
yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus
listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal
elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik
2004). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya
muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan
intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk
konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga
memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002).
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh
objek, E adalah medan listrik.
Secara
umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada
pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group
ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam
mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi
dan medium yang sesuai.
Ø
Prinsip
kerja Elektrofoesis
Prinsip kerja
dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif (+)
pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) pada kutub positif
(+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil
yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan
informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut
kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
|
Skema Elektroforesis
|
Dari gambar diatas dapat
dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif akan bergerak searah dengan medan
listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam campuran terdapat dua jenis
komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2) komponen netral (N), maka
komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif (+) sedangkan komponen
netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis secara sederhana dapat
dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut dapat dilihat komponen
yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub negatif, sedangkan komponen
bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub positif.
|
Elektroforesis
merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan
listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan
untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).
|
C. Manfaat Elektroforesis
1. Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan
asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell
2. Elektroforesis selalu digunakan untuk menentukan
komposisi protein suatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbedaan yang
terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang kedelai dan
pekatan protein gandum yang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan.
Elektroforesis dapat juga digunakan untuk menentukan kadar kemurnian suatu
protein.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bermuatan tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein yang diketahui berat molekulnya. Protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bermuatan tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein yang diketahui berat molekulnya. Protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
3. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan
analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa,
PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.
4. Kemurnian protein dinilai oleh elektroforesis gel poliakrilamid , metode yang digunakan untuk menentukan kemurnian suatu protein menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (polyacrylamide gel elektrophoresis). Dimana elektroforesis memisahkan biomolekul – biomolekul bermuatan berdasarkan laju migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik.
5. Untuk menganalisis protein plasma dalam darah. Di dalam protein plasma terdapat banyak jenis elektroforesis , yang masing – masing menggunakan medium penopang / penunjang yang berbeda. Di laboratorium klinik, selulosa asetat digunakan secara luas sebagai medium penunjang. Pada pemakaian bahan ini protein plasma dapat dipisah- pisahkan, setelah pemulasan , mejadi lima pita , yang masing- masing dinamai fraksi albumin α1,α2,β , dan γ.
4. Kemurnian protein dinilai oleh elektroforesis gel poliakrilamid , metode yang digunakan untuk menentukan kemurnian suatu protein menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (polyacrylamide gel elektrophoresis). Dimana elektroforesis memisahkan biomolekul – biomolekul bermuatan berdasarkan laju migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik.
5. Untuk menganalisis protein plasma dalam darah. Di dalam protein plasma terdapat banyak jenis elektroforesis , yang masing – masing menggunakan medium penopang / penunjang yang berbeda. Di laboratorium klinik, selulosa asetat digunakan secara luas sebagai medium penunjang. Pada pemakaian bahan ini protein plasma dapat dipisah- pisahkan, setelah pemulasan , mejadi lima pita , yang masing- masing dinamai fraksi albumin α1,α2,β , dan γ.
D. Elektroforesis Protein
Metoda yang
paling umum untuk memisahkan protein adalah dengan cara elektroforesis
menggunakan discontinuous polyacrylamide gel sebagai medium penyangga dan
sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk mendenaturasi protein. Metoda ini disebut
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Metoda
ini disebut juga “Laemmli method” karena penemunya U.K. Laemmli, adalah yang
pertama kali menggunakan metoda SDS-PAGE.
Fungsi SDS
SDS ( Lauril
Sulfat) adalah suatu detergen anionik yang apabila dilarutkan
molekulnyamemiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Suatu rantai
polipeptida dapat berikatan dengan sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul.
Muatan SDS akan menghancurkan sebagian besar struktur kompleks protein, dan
secara kuat tertarik ke arah anoda (positively - char–ed electrode) bila
ditempatkan pada suatu elektrik.
1-D
Electrophoresis
Ketika protein
dan macromolekul lain ditreatment dengan SDS suatu strong detergen , maka
mereka akan ter denaturasi akan bermuatan negatif. Jumlah yang berikatan akan
proporsional dengan masa. Jumlah yang tertarik per unit massa di electric
fields adalah sama dan seluruh molekul akan bergerak dengan kecepatan yang sama
bila tidak ada friksi. Pada proses electrophoresis dengan SDS dilakukan di
dalam suatu gel yang akan melewati pori-pori gel seingga kemudahan pergerakan
melalui pori tergantung pada diameter molekul. Molekul yang lebih besar akan
tertahan dan akibatnya bergerak lebih lambat. Karena molekul
terdenaturasi,diameter nya tergantung dariberat molekulnya. Makin besar
diameter molekul,maka pergerakan semakin lambat. Dengan demikian
electrophoresis dan SDS akan memisahkan molekul berdasarkan molecul weight
tidak hanya negative charge.
2-Dimensional
Electrophoresis
Jenis gel yang
umum digunakan adalah 2-D polyacrylamide gel electrophoresis. Berguna untuk
memisahkan ,identifikasi,dan menukur seluruh protein yang terdapat dalam suatu
sample sel
Prosedur Kerja
Elektroforesis
gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar
teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam kandungan gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA,
atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis).
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Dengan kata lain gel poliakrilamid dapat digunakan pada berbagai jenis protein dan asam nukleat.
Gambar Reaksi Pembentukan Gel Poliakrilamid
SDS gel elektroforesis
Sistem elektroforesis gel SDS digunakan untuk memutuskan dan mengkarakterisasi nomor dan ukuran rantai protein atau rantai protein subunit di dalam suatu persiapan protein. Pada dasarnya persiapan protein ini dilakukan dengan adanya tiol yang larut (R-SH, contohnya β-mercaptoethanol) dan SDS. Di bawah kondisi ini, R-SH mereduksi semua ikatan disulfida di dalam protein, yang mana detergen SDS mengikat semua wilayah protein dan menguraikan semua interaksi intramolekuler protein. Hasil ini dalam pengacauan total protein dan pengacauan hubungan antar subunit dan kemudian membawa hasil SDS, rantai polipeptida anionik tinggi. Rantai protein anionic yang terdenaturasi kemudian terurai secara elekroforesik dalam lingkungan buffer yang mengandung tiol dan SDS serta gel poliakrilamid konsentrasi tinggi. Tiol dan SDS mempertahankan posisi terdenaturasi dari protein atau subunit protein. Ikatan SDS pada protein membangkitkan muatan anionic yang konstan ke perbandingan masa untuk seluruh rantai protein yang terurai sementara gel dengan konsentrasi tinggi membangkitkan penyaring molecular, dimana viskositas dan ukuran pori dari gel menentukan pergerakan. Sebagai hasilnya pergerakan yang relative dari tiap anionic rantai polipeptida yang terdenaturasi adalah fungsi log dari bobot molekul rantai polipeptida.
Sistem gel SDS mudah dan bermanfaat sebagai alat elektroforesis gel kuantitatif dan kualitatif. Secara spesifik, persiapan protein murni dapat dianalisis homogenitasnya, hal ini untuk protein yang hasil ikatan selama pewarnaanya sedikit. Dengan kata lain protein murni dapat dianalisis jumlah dan ukuran dari subunit molekularnya.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis).
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Dengan kata lain gel poliakrilamid dapat digunakan pada berbagai jenis protein dan asam nukleat.
Gambar Reaksi Pembentukan Gel Poliakrilamid
SDS gel elektroforesis
Sistem elektroforesis gel SDS digunakan untuk memutuskan dan mengkarakterisasi nomor dan ukuran rantai protein atau rantai protein subunit di dalam suatu persiapan protein. Pada dasarnya persiapan protein ini dilakukan dengan adanya tiol yang larut (R-SH, contohnya β-mercaptoethanol) dan SDS. Di bawah kondisi ini, R-SH mereduksi semua ikatan disulfida di dalam protein, yang mana detergen SDS mengikat semua wilayah protein dan menguraikan semua interaksi intramolekuler protein. Hasil ini dalam pengacauan total protein dan pengacauan hubungan antar subunit dan kemudian membawa hasil SDS, rantai polipeptida anionik tinggi. Rantai protein anionic yang terdenaturasi kemudian terurai secara elekroforesik dalam lingkungan buffer yang mengandung tiol dan SDS serta gel poliakrilamid konsentrasi tinggi. Tiol dan SDS mempertahankan posisi terdenaturasi dari protein atau subunit protein. Ikatan SDS pada protein membangkitkan muatan anionic yang konstan ke perbandingan masa untuk seluruh rantai protein yang terurai sementara gel dengan konsentrasi tinggi membangkitkan penyaring molecular, dimana viskositas dan ukuran pori dari gel menentukan pergerakan. Sebagai hasilnya pergerakan yang relative dari tiap anionic rantai polipeptida yang terdenaturasi adalah fungsi log dari bobot molekul rantai polipeptida.
Sistem gel SDS mudah dan bermanfaat sebagai alat elektroforesis gel kuantitatif dan kualitatif. Secara spesifik, persiapan protein murni dapat dianalisis homogenitasnya, hal ini untuk protein yang hasil ikatan selama pewarnaanya sedikit. Dengan kata lain protein murni dapat dianalisis jumlah dan ukuran dari subunit molekularnya.
Bab 3 Simpulan
Elektroforesis
merupakan metode yang digunakan untuk penentuan kadar kemurnian suatu protein,
menganalisis protein plasma, juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat
molekul protein yang belum di ketahui.
Elektroforesis mempunyai berbagai tipe, antara lain: Elektroforesis Gel dan Elektroforesis Paper
Elektroforesis mempunyai berbagai tipe, antara lain: Elektroforesis Gel dan Elektroforesis Paper
Daftar Pustaka
Davidson,
Victor. L. , Donald B. S ,1999, Biochemistry 4th Edition, Lippincott Williams
and Walkins, Philadelphia, USA
Mathew, Christopher K., 1990, Biochemistry, 54-57, The Benjamin/ Cummings, California
Mayes, Peter .A , 1993, Biokimia, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Moran, Laurence A., Scrimgeur, K Gray, 1994, Biochemistry 2nd Edition, Neil Patterson Publisher/ Prentice Hall, Inc., UK
Mathew, Christopher K., 1990, Biochemistry, 54-57, The Benjamin/ Cummings, California
Mayes, Peter .A , 1993, Biokimia, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Moran, Laurence A., Scrimgeur, K Gray, 1994, Biochemistry 2nd Edition, Neil Patterson Publisher/ Prentice Hall, Inc., UK
http://kumpulan-makalah-baru.blogspot.com/2012/06/elektroforesis.html
http://majalahkimia.blogspot.com/2011/12/elektroforesis.html
https://www.scribd.com/doc/183737663/Elektroforesis-adalah-teknik-pemisahan-komponen-atau-molekul-bermuatan-berdasarkan-perbedaan-tingkat-migrasinya-docx
http://kamriantiramli.wordpress.com/2011/05/08/elektroforesis/
Komentar
Posting Komentar